PCR, ir polimerāzes ķēdes reakcija, kas attiecas uz dNTP, Mg2+, pagarinājuma faktoru un amplifikācijas pastiprināšanas faktoru pievienošanu sistēmai DNS polimerāzes katalīzes laikā, izmantojot sākotnējo DNS kā veidni un specifiskus primerus kā pagarinājuma sākumpunktu, Veicot denaturēšanas, atkausēšanas, pagarināšanas utt. soļus, in vitro meitas virknes DNS replikācijas process, kas ir komplementārs sākotnējā virknes veidnes DNS, var ātri un specifiski pastiprināt jebkuru mērķa DNS in vitro.
1. Hot Start PCR
Pastiprināšanas sākuma laiks parastajā PCR nav PCR iekārtas ievietošana PCR iekārtā, un tad programma sāk pastiprināties.Kad sistēmas konfigurēšana ir pabeigta, sākas pastiprināšana, kas var izraisīt nespecifisku pastiprināšanos, un karstās palaišanas PCR var atrisināt šo problēmu.
Kas ir karstās palaišanas PCR?Pēc reakcijas sistēmas sagatavošanas enzīmu modifikators tiek atbrīvots augstā temperatūrā (parasti augstāk par 90°C) reakcijas sākotnējā karsēšanas stadijā jeb “karstās palaišanas” stadijā, tādējādi tiek aktivizēta DNS polimerāze.Precīzs aktivizācijas laiks un temperatūra ir atkarīga no DNS polimerāzes veida un karstās palaišanas modifikatora.Šī metode galvenokārt izmanto modifikatorus, piemēram, antivielas, afinitātes ligandus vai ķīmiskos modifikatorus, lai inhibētu DNS polimerāzes aktivitāti.Tā kā DNS polimerāzes aktivitāte tiek inhibēta istabas temperatūrā, karstās palaišanas tehnoloģija nodrošina lielu ērtību vairāku PCR reakciju sistēmu sagatavošanai istabas temperatūrā, nezaudējot PCR reakciju specifiku.
2. RT-PCR
RT-PCR (reversās transkripcijas PCR) ir eksperimentāls paņēmiens reversai transkripcijai no mRNS uz cDNS un izmantojot to kā amplifikācijas veidni.Eksperimentālā procedūra ir vispirms iegūt kopējo RNS audos vai šūnās, izmantot Oligo (dT) kā primeru, izmantot reverso transkriptāzi, lai sintezētu cDNS, un pēc tam izmantot cDNS kā veidni PCR amplifikācijai, lai iegūtu mērķa gēnu vai noteiktu gēna ekspresiju.
3. Fluorescējošā kvantitatīvā PCR
Fluorescējošā kvantitatīvā PCR (reālā laika kvantitatīvā PCR,RT-qPCR) attiecas uz metodi fluorescējošu grupu pievienošanai PCR reakcijas sistēmai, izmantojot fluorescējošu signālu uzkrāšanos, lai reāllaikā uzraudzītu visu PCR procesu, un visbeidzot izmantojot standarta līkni, lai kvantitatīvi analizētu veidni.Parasti izmantotās qPCR metodes ietver SYBR Green I un TaqMan.
4. Ligzdota PCR
Nested PCR attiecas uz divu PCR primeru komplektu izmantošanu divām PCR amplifikācijas kārtām, un otrās kārtas amplifikācijas produkts ir mērķa gēna fragments.
Ja pirmā primeru pāra (ārējo praimeru) neatbilstība izraisa nespecifiska produkta pastiprināšanos, iespēja, ka otrais primeru pāris atpazīs to pašu nespecifisko reģionu un turpinās amplifikāciju, ir ļoti maza, tāpēc amplifikācija ar otro praimeru pāri, ir uzlabota PCR specifika.Viena no priekšrocībām, veicot divas PCR kārtas, ir tā, ka tā palīdz pastiprināt pietiekami daudz produkta no ierobežotas sākuma DNS.
5. Piezemēšanās PCR
Touchdown PCR ir metode, lai uzlabotu PCR reakcijas specifiku, pielāgojot PCR cikla parametrus.
Pieskāriena PCR atkausēšanas temperatūra pirmajos dažos ciklos tiek iestatīta par dažiem grādiem virs primeru maksimālās atkausēšanas temperatūras (Tm).Augstāka atkausēšanas temperatūra var efektīvi samazināt nespecifisko amplifikāciju, bet tajā pašā laikā augstāka atkausēšanas temperatūra pasliktinās primeru un mērķa sekvenču atdalīšanu, kā rezultātā samazinās PCR iznākums.Tāpēc pirmajos dažos ciklos atkausēšanas temperatūra parasti tiek samazināta par 1 ° C ciklā, lai palielinātu mērķa gēna saturu sistēmā.Kad atkausēšanas temperatūra tiek pazemināta līdz optimālajai temperatūrai, atkausēšanas temperatūra tiek uzturēta atlikušajos ciklos.
6. Tiešā PCR
Tiešā PCR attiecas uz mērķa DNS pastiprināšanu tieši no parauga bez nepieciešamības izolēt un attīrīt nukleīnskābes.
Ir divu veidu tiešā PCR:
tiešā metode: ņemiet nelielu daudzumu parauga un pievienojiet to tieši PCR Master Mix PCR identificēšanai;
krekinga metode: pēc parauga parauga ņemšanas pievienojiet to lizātam, lizējiet, lai atbrīvotu genomu, paņemiet nelielu daudzumu lizētā supernatanta un pievienojiet to PCR Master Mix, veiciet PCR identifikāciju.Šī pieeja vienkāršo eksperimentālo darbplūsmu, samazina praktisko laiku un novērš DNS zudumu attīrīšanas posmos.
7. SOE PCR
Gēnu savienošana ar pārklāšanās pagarinājuma PCR (SOE PCR) izmanto praimerus ar komplementāriem galiem, lai PCR produkti veidotu pārklājošas ķēdes, lai nākamajā amplifikācijas reakcijā, pagarinot pārklājošās ķēdes, dažādi A tehnikas avoti, kuros amplificētie fragmenti tiek pārklāti. un salabot kopā.Šai tehnoloģijai šobrīd ir divi galvenie pielietojuma virzieni: saplūšanas gēnu konstruēšana;uz gēna vietu vērsta mutācija.
8. IPCR
Apgrieztā PCR (IPCR) izmanto apgrieztos komplementāros primerus, lai pastiprinātu DNS fragmentus, kas nav divi praimeri, un pastiprina nezināmas sekvences zināma DNS fragmenta abās pusēs.
IPCR sākotnēji tika izstrādāts, lai noteiktu blakus esošo nezināmo reģionu secību, un to galvenokārt izmanto, lai pētītu gēnu promotora sekvences;onkogēnas hromosomu pārkārtošanās, piemēram, gēnu saplūšana, translokācija un transponēšana;un vīrusa gēnu integrācija, tiek plaši izmantotas arī tagad Vietnei virzītai mutaģenēzei kopējiet plazmīdu ar vēlamo mutāciju.
9. dPCR
Digitālā PCR (dPCR) ir paņēmiens nukleīnskābju molekulu absolūtai kvantitatīvai noteikšanai.
Pašlaik ir trīs metodes nukleīnskābju molekulu kvantitatīvai noteikšanai.Fotometrija balstās uz nukleīnskābju molekulu absorbciju;reāllaika fluorescējošā kvantitatīvā PCR (Real Time PCR) ir balstīta uz Ct vērtību, un Ct vērtība attiecas uz cikla numuru, kas atbilst fluorescences vērtībai, kuru var noteikt;digitālā PCR ir jaunākā kvantitatīvā tehnoloģija, kuras pamatā ir vienas molekulas PCR metode nukleīnskābju skaitīšanai. Kvantitatīvā noteikšana ir absolūta kvantitatīvā metode.
Izlikšanas laiks: 13. jūnijs 2023