Ultrafiltrācijas centrifūgas caurules lietošana un piesardzība
1) Izvēlieties piemērotu ultrafiltrācijas cauruli.Ņemiet vērā, ka UF membrānas atšķiras ar tolerances līmeni pret dažādām ķīmiskām vielām.Parasti ultrafiltrācijas caurules ar 10 kDa molekulmasas robežvērtību var izvēlēties ar molekulmasas robežvērtību, kas nedrīkst būt lielāka par 1/3 no interesējošā proteīna molekulmasas, piemēram, 35 kDa.Ja interesējošā proteīna molekulmasa ir aptuveni 10 kd, var izmantot ultrafiltrācijas cauruli ar molekulmasas robežvērtību 3 KD.
(2) Svaigi iegādātā ultrafiltrācija ir sausa, pirms lietošanas ir pievienots īpaši tīrs ūdens, un ūdens ir pilnībā izlaists caur membrānu, ledus vannu vai ledusskapi, kas ir iepriekš atdzesēts dažas minūtes.Pēc tam ūdeni, ti, olbaltumvielu šķidrumu, nolej un pievieno, atkarībā no tā, kurš nav lielāks par balto līniju caurules augšpusē.Darbība ir viegla, un pirms proteīna šķīduma pievienošanas ultrafiltrācijas caurule ir iepriekš jāatdzesē uz ledus.
3) gan masai, gan smaguma centram bija jāsasniedz līdzsvars.Ņemiet vērā, ka rotācijas ātrums un paātrinājums nav ļoti ātrs, pretējā gadījumā tiešā veidā tiek bojāta ultrafiltrācijas membrāna.Tika uzsākta centrbēdzes ultrafiltrācija (centrifūga iepriekš atdzesēta līdz 4 grādiem).Pēc tam, kad dažādu centrifūgu RPM tika pārveidots par g, tas bija atšķirīgs.Centrifūgas paātrinājums tika noregulēts līdz minimumam, samazinot spiedienu uz membrānu.Ņemiet vērā: noteikti atstājiet centrifūgu pēc tam, kad centrifūga ir sasniegusi galamērķa ātrumu, vai arī, ja jums ir problēma, jūs ar to nevarat rīkoties pirmo reizi.Membrānas orientācija uz vārpstu tika noregulēta saskaņā ar instrukcijām (leņķiskais centrifūgas korpuss ir perpendikulāra membrānai pret asi).Praktiskā lietošanā vispārējais griešanās ātrums ir mazāks nekā instrukcijā norādītais, lai varētu pagarināt centrifūgas caurules kalpošanas laiku.
3) gan masai, gan smaguma centram bija jāsasniedz līdzsvars.Ņemiet vērā, ka rotācijas ātrums un paātrinājums nav ļoti ātrs, pretējā gadījumā tiešā veidā tiek bojāta ultrafiltrācijas membrāna.Tika uzsākta centrbēdzes ultrafiltrācija (centrifūga iepriekš atdzesēta līdz 4 grādiem).Pēc tam, kad dažādu centrifūgu RPM tika pārveidots par g, tas bija atšķirīgs.Centrifūgas paātrinājums tika noregulēts līdz minimumam, samazinot spiedienu uz membrānu.Ņemiet vērā: noteikti atstājiet centrifūgu pēc tam, kad centrifūga ir sasniegusi galamērķa ātrumu, vai arī, ja jums ir problēma, jūs ar to nevarat rīkoties pirmo reizi.Membrānas orientācija uz vārpstu tika noregulēta saskaņā ar instrukcijām (leņķiskais centrifūgas korpuss ir perpendikulāra membrānai pret asi).Praktiskā lietošanā vispārējais griešanās ātrums ir mazāks nekā instrukcijā norādītais, lai varētu pagarināt centrifūgas caurules kalpošanas laiku.
(4) Kad tas ir koncentrēts līdz atlikušajam 1 ml, paņemiet 50 ul buferšķīduma, pievienojiet 10 ul caurplūdes un pārbaudiet, vai ir zila krāsa, lai noteiktu, vai ultrafiltrācijas mēģenē trūkst proteīna.Ja caurulē ir noplūde, atkārtoti ielejiet augšējo slāni un ieplūstiet jaunā caurulē, lai sāktu ultrafiltrāciju.Lai precīzi noteiktu, vai mēģenes ir izlaistas, centrifugējiet 10 minūtes ar 5mgml BSA pirms caurplūdes, darbināšanas ar proteīna līmi vai Bredfordas jēlnaftas testu, un turpiniet, pievienojot atlikušo koncentrēto proteīna šķīdumu (kas darbojas uz ledus un neļauj olbaltumvielām uzkarst), līdz. ir pievienots viss koncentrāts.Uzmanieties centrifugēšanas laikā, ja notiek olbaltumvielu nogulsnēšanās, kas noved pie mēģenes aizvēršanās.Ja rodas nokrišņi, noskaidro, vai konkrētais nokrišņu cēlonis ir pārmērīga olbaltumvielu koncentrācija vai nepiemērots buferšķīdums;Pirmo var atrisināt, vienlaikus ultrafiltrējot vairākas ultrafiltrācijas caurules, samazinot koncentrāciju, bet otro, mainot dažādus buferšķīdumus, līdz nenotiek proteīna nogulsnēšanās.
(4) Kad tas ir koncentrēts līdz atlikušajam 1 ml, paņemiet 50 ul buferšķīduma, pievienojiet 10 ul caurplūdes un pārbaudiet, vai ir zila krāsa, lai noteiktu, vai ultrafiltrācijas mēģenē trūkst proteīna.Ja caurulē ir noplūde, atkārtoti ielejiet augšējo slāni un ieplūstiet jaunā caurulē, lai sāktu ultrafiltrāciju.Lai precīzi noteiktu, vai mēģenes ir izlaistas, centrifugējiet 10 minūtes ar 5mgml BSA pirms caurplūdes, darbināšanas ar proteīna līmi vai Bredfordas jēlnaftas testu, un turpiniet, pievienojot atlikušo koncentrēto proteīna šķīdumu (kas darbojas uz ledus un neļauj olbaltumvielām uzkarst), līdz. ir pievienots viss koncentrāts.Uzmanieties centrifugēšanas laikā, ja notiek olbaltumvielu nogulsnēšanās, kas noved pie mēģenes aizvēršanās.Ja rodas nokrišņi, noskaidro, vai konkrētais nokrišņu cēlonis ir pārmērīga olbaltumvielu koncentrācija vai nepiemērots buferšķīdums;Pirmo var atrisināt, vienlaikus ultrafiltrējot vairākas ultrafiltrācijas caurules, samazinot koncentrāciju, bet otro, mainot dažādus buferšķīdumus, līdz nenotiek proteīna nogulsnēšanās.
(5) Pirmās dažas darbības tiek izmantotas, lai koncentrētu proteīnu, un, ja buferis ir jāmaina, uzmanīgi pievienojiet jaunu buferšķīdumu (ultrafiltrēšana caur 0,22 um ultrafiltrācijas membrānu) apmēram 1 ml kopējā proteīna un atkārtoti koncentrējiet līdz apmēram 1 ml trīs reizes. reizes pēc kārtas ar galīgo koncentrēto gala tilpumu atkarībā no vēlamās olbaltumvielu koncentrācijas, parasti ne vairāk kā 500 ul, bet arī 200 ul robežās.Trīs reizes panāk 1000 × vai vairāk, būtībā tik daudz bufera izmaiņu, kas aprēķināts, katru reizi palielinot tilpumu vismaz par 10 × vai vairāk.
(5) Pirmās dažas darbības tiek izmantotas, lai koncentrētu proteīnu, un, ja buferis ir jāmaina, uzmanīgi pievienojiet jaunu buferšķīdumu (ultrafiltrēšana caur 0,22 um ultrafiltrācijas membrānu) apmēram 1 ml kopējā proteīna un atkārtoti koncentrējiet līdz apmēram 1 ml trīs reizes. reizes pēc kārtas ar galīgo koncentrēto gala tilpumu atkarībā no vēlamās olbaltumvielu koncentrācijas, parasti ne vairāk kā 500 ul, bet arī 200 ul robežās.Trīs reizes panāk 1000 × vai vairāk, būtībā tik daudz bufera izmaiņu, kas aprēķināts, katru reizi palielinot tilpumu vismaz par 10 × vai vairāk.
Izlikšanas laiks: Nov-09-2022